Revista Mexicana de Ciencias Forestales Vol. 13 (73)

Septiembre – Octubre (2022)

Fecha de recepción/Reception date: 17 marzo de 2022

Fecha de aceptación/Acceptance date: 11 de agosto de 2022

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¹Maestría en Ciencias Forestales, División de Ciencias Forestales, Universidad Autónoma Chapingo. México.

²División de Ciencias Forestales, Universidad Autónoma Chapingo. México.

³Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE). México.

⁴Recursos Genéticos y Productividad, Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo. México.

*Autor por correspondencia; correo-e: oalejandrovera@gmail.com

*Corresponding author; e-mail: oalejandrovera@gmail.com

Resumen

El mosquito fungoso negro es un díptero que causa severos daños en plantas ornamentales y en viveros forestales que cultivan especies de Pinus en el centro de México, con pérdidas superiores al 30 %. Los informes más recientes del mosquito fungoso negro son de 2013 y 2015; se desconoce la distribución actual del género Bradysia. Por lo anterior, los objetivos del presente estudio consistieron en identificar morfológica y molecularmente a las especies del mosquito, conocer su distribución y las especies de pino que ataca en cinco regiones de México. Se realizó un muestreo de abril a junio de 2019 en 20 viveros con especies de pino. Las muestras recolectadas se colocaron en cámaras de emergencia durante 45 días en condiciones de fotoperiodo 12:12 h y humedad relativa (HR) de 75 %. Se obtuvieron 934 adultos, y la especie identificada por caracterización morfológica y un fragmento del gen mitocondrial COI correspondió a Bradysia impatiens (Johannsen, 1912) (Diptera: Sciaridae), presente en 17 especies de pino y, como nuevos hospederos, en Pinus arizonica, P. ayacahuite, P. cembroides, P. cooperi, P. douglasiana, P. durangensis, P. engelmannii, P. hartwegii, P. leiophylla, P. oaxacana, P. oocarpa, P. patula y P. teocote. Además, el mosquito fungoso se registró en nueve estados mexicanos: Chiapas, Chihuahua, Durango, Hidalgo, Jalisco, Oaxaca, Querétaro, Veracruz y Zacatecas. Actualmente, B. impatiens se conoce en 15 estados de la república mexicana.

Palabras clave: Bradysia impatiens (Johannsen, 1912), COI, mosquito fungoso negro, Pinus, plaga, viveros forestales.

Abstract

The black fungus gnat is a dipteran that causes severe damage to ornamental plants and forest nurseries with Pinus species in central Mexico, with losses over 30 %. The most recent reports of the black fungus gnat are from 2013 and 2015; the current distribution of the genus Bradysia sp. is unknown. Therefore, the objectives of this study were to identify the black fungus gnat morphologically and molecularly, as well as to know its distribution on pine species on five regions of Mexico. Sampling was carried out from April to June 2019 in 20 nurseries with pine species. The collected samples were placed in emergency chambers for 45 days under photoperiod conditions of 12:12 h and relative humidity (RH) of 75 % for obtaining the adults. 934 adults of black fungus gnat were obtained, and the species identified by morphology and molecularly through a fragment of the mitochondrial COI gene corresponds to Bradysia impatiens (Johannsen, 1912) (Diptera: Sciaridae), present in 17 pine species, including Pinus arizonica, P. ayacahuite, P. cembroides, P. cooperi, P. douglasiana, P. durangensis, P. engelmannii, P. hartwegii, P. leiophylla, P. oaxacana, P. oocarpa, P. patula and P. teocote, as new hosts. In addition, the fungus gnat is recorded for the first time in nine Mexican states: Chiapas, Chihuahua, Durango, Hidalgo, Jalisco, Oaxaca, Querétaro, Veracruz and Zacatecas. Currently, B. impatiens is known in 15 states of Mexico.

Key words: Bradysia impatiens (Johannsen, 1912), COI, black fungus gnat, Pinus, pest, forest nurseries.

Introducción

En la actualidad, en México el 90% de las plantas de coníferas se producen en viveros forestales bajo un sistema de producción de contenedores (Conafor, 2016). En estos viveros, el mosquito fungoso negro de la familia Sciaridae es considerado una plaga. En el mundo se han descrito alrededor de 2 400 especies (Mohrig y Menzel, 2009). En la región Neártica, que comprende Canadá, Estados Unidos y Norte de México, se estiman 166 especies de 25 géneros (Mohrig et al., 2012). A pesar de su importancia económica y ecológica, los ciáridos han sido poco estudiados debido a su tamaño pequeño, modo de vida y la dificultad para determinar su identidad taxonómica (Mohrig y Menzel, 2009; Villanueva-Sánchez et al., 2013).

En viveros del centro de México, las especies Bradysia impatiens Johannsen, 1912 y Lycoriella ingenua Dufour, 1839 causan pérdidas económicas hasta de 30 % en la producción de plántulas de pino, aun cuando se aplica medidas culturales de control biológico, químico y físico (Cibrián et al., 2008; Marín-Cruz et al., 2015a; García, 2017). En Italia, B. impatiens causa daños en plantas de eucalipto (Mansilla et al., 2001) y en Sudáfrica ataca plántulas de pino (Hurley et al., 2007, Hurley et al., 2010).

Ambas especies de dípteros son comunes en invernaderos, viveros, plantas en macetas, cultivo de hongos comestibles y materia orgánica en descomposición (Menzel et al., 2003; Mohrig y Menzel, 2009; Shin et al., 2012). Bradysia Winnertzes el género más numeroso en la familia con 433 especies en comparación con las 85 especies de Lycoriella (Menzel y Mohrig, 1999).

Las larvas de los ciáridos provocan daño directo al alimentarse de la raíz e indirecto por la capacidad de transmitir hongos fitopatógenos como Botrytis cinérea Pers. 1797, Pythium sp. nov., Fusarium oxysporum Schltd., 1824, Verticillium alboatrum Reinke & Berthold, 1879, Verticillium fungicola (Preuss) Hassebr., 1936 y Fusarium circinatum Nirenberg & O’ Donnell 1998 (Hurley et al., 2007; Shamshad et al., 2009; Cloyd, 2015; Marín-Cruz et al., 2015b). Estos insectos se dispersan a nuevas áreas por medio del movimiento de plantas por los humanos y de sustratos como la turba (Marín-Cruz et al., 2015b); su presencia es cosmopolita (Mohrig et al., 2012; Shin et al., 2012). En México se desconoce la extensión actual que ocupa el mosquito fungoso y que especies de ciáridos están en las especies de pino. Por lo anterior, los objetivos del presente estudio consistieron en identificar a las especies de mosquito fungoso negro por caracterización morfológica y molecular, y conocer su distribución y las especies de pino que atacan en cinco regiones de México.

Materiales y Métodos

Recolección de muestras

Las muestras se recolectaron en 20 viveros forestales (abril a junio de 2019), los cuales producen pinos para la reforestación; 19 viveros tienen el sistema de producción en contenedores y uno usa bolsa de polipropileno (La Gloria). Los viveros se localizan en 12 estados de la república mexicana (Cuadro 1) y que pertenecen a cinco regiones geográficas (I=Norte, II=Occidente, III=Centro, IV=Golfo, V=Sur). En cada vivero se recolectaron muestras por especie en producción al momento de la visita, cuya selección se hizo mediante un muestreo dirigido.

Cuadro 1. Localización de viveros forestales en el ciclo de producción 2018-2019 en cinco regiones de México.

 Las muestras consistieron en cuatro plantas con cepellón por especie. Solo se escogieron ejemplares con manifestaciones de marchitez, follaje de color verde amarillento, desprendimiento de hojas, pudrición de raíz y poco crecimiento, síntomas provocados por las larvas del mosquito fungoso en pino. Cada muestra se guardó en bolsas herméticas Ziploc^® para evitar la posible contaminación de otras muestras. En total se recolectaron 20 muestras del género Pinus (80 árboles). Las muestras se procesaron en el insectario del Laboratorio de Parasitología Forestal en la División de Ciencias Forestales de la Universidad Autónoma Chapingo para su análisis correspondiente.

Procesamiento de plantas recolectadas y emergencia de adultos

Las plantas recolectadas con cepellón se colocaron en cámaras de emergencia de adultos en condiciones de fotoperiodo 12:12 h y humedad relativa (HR) de 75 %. Las cámaras consistieron en envases de un litro, de plástico transparente con tapa perforada en el centro con un círculo de 3 cm de diámetro (para recolectar los adultos de mosquito fungoso, así como suministrar agua y alimento); esta perforación se cubrió con un tapón de gasa y algodón. Las cámaras de emergencia se revisaron cada 24 horas durante 45 días. De cada una de las muestras colocadas en las cámaras de cría, se tomaron ejemplares adultos del mosquito fungoso con un aspirador manual, mismos que se sacrificaron y se conservaron en etanol al 70 % y 100 % para su identificación morfológica y molecular.

Identificación morfológica

La identificación de los ejemplares se hizo con un microscopio estereoscopio Leica^® EZ4; en primera instancia, se les separó por sexo. Posteriormente, a 20 machos se les realizaron cortes de los genitales, cabeza, palpos, tibias y alas, estructuras que se prepararon en laminillas con azul de algodón para aclarar los tejidos (Poinar y Thomas, 1984). Se utilizó un microscopio óptico compuesto Leica^® M80 y una cámara modelo DFC295 de la misma marca, con la cual se tomaron fotografías de las estructuras con fines de determinación de las especies. Para ello se usaron las claves taxonómicas de la familia Sciaridae de Menzel et al. (2003), Mohrig y Menzel (2009), Mohrig et al. (2012), Shin et al. (2012) y Marín-Cruz et al. (2015a).

A fin de corroborar la identificación taxonómica, se envió una muestra de 8 adultos (4 ♂ y 4 ♀) por vivero al M. C. Herón Huerta, responsable de la Colección de Artrópodos con Importancia Médica (CAIM) del Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE). El material fue depositado en la colección entomológica de la División de Ciencias Forestales (Dicifo) de la Universidad Autónoma Chapingo (UACh) con número de registro 28x+48.

Extracción de ADN, amplificación del gen COI, PCR y análisis

El ADN genómico se extrajo a partir de adultos completos (un adulto por vivero) por el método de CTAB (Stewart y Via, 1993). El ADN se cuantificó en un Nanodrop ND 1 000 (Thermo Scientific, USA). De cada una de las muestras de ADN se prepararon diluciones a 20 ng para la amplificación del gen Citocromo Oxidada I (COI) por medio de la PCR con los oligonucleótidos LCO1490 (GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG) y HCO2198 (TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA) (Folmer et al., 1994). Los productos amplificados se limpiaron con kit ExoSAP-IT™ (Thermo Fisher Scientific, USA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se enviaron a secuenciar en el Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).

Las secuencias se ensamblaron y editaron con Bioedit 7.0.5 (Hall, 1999) y se compararon con secuencias depositadas en el GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information, www.ncbi. nih.gov) por medio del programa BLAST. Para confirmar la identificación morfológica, se llevó a cabo un análisis filogenético con secuencias de referencia del GenBank (KX538548, MW798234, OM421642) y junto con las obtenidas de este estudio fueron alineados con el método Clustal W y procesadas con el método Maximun Likelihood basado en el modelo de Tamura de tres parámetros con 5 000 replicaciones bootstrap (Tamura, 1992) con el programa MEGA 11 (Tamura et al., 2021).

Para el árbol filogenético se usó como raíz una secuencia de Psychoda alternata Say, 1824del GenBank con número de acceso LC422861. Todas las secuencias de este estudio fueron depositadas en el GenBank para obtener su número de acceso.

Resultados y Discusión

En total se recolectaron 934 adultos de mosquito fungoso negro con un promedio de 46.7 adultos por vivero forestal y 100 % correspondieron a la especie B. impatiens, considerada la plaga principal en las cinco regiones de muestreo (Figura 1).

Figura 1. Distribución de Bradysia impatiens Johannsen, 1912 en México.

A fin de facilitar la identificación de B. impatiens, a continuación se describen sus características: Adultos de color gris oscuro a negro, de 2 a 2.5 mm de longitud, hembra más grande que el macho. Cabeza redondeada a ovoide con ojos moderadamente prominentes con piezas bucales ligeramente prolongadas (Figura 2A). Antena: 14 flagelómeros, cuarto flagelómero 1.6 veces más largo que ancho, superficie ligeramente rugosa (Figura 2B-C). Palpo: moderadamente largo, amarillo a pardo claro, con tres segmentos, segmento basal con la fosa sensorial profunda, sensilas largas, ligeramente curvadas con punta roma (Figura 2D). Tibia: Lado interno de la tibia anterior con una hilera de 10 sedas; tibia media y posterior con dos sedas delgadas en forma de espolones, subiguales (Figura 2E). Genitales: compactados, sin lóbulo basal o grupo de sedas en la vista ventral. Gonocoxito corto, cubierto con sedas oscuras, así como sedas gruesas y largas principalmente en la base (Figura 2F). Tergito 9 corto, trapezoidal, ligeramente emarginado apicalmente con varias sedas largas. Tegmen ligeramente más ancho que largo, redondeado apicalmente; edeago con base esclerotizada, longitud 0.1 mm. Gonostilo: 2.5 veces más largo que ancho, ocho espinas subiguales curvadas ventromedialmente y una espina apical gruesa (Figura 2F). Ala: con longitud total 1.95 mm, anchura 0.80 mm, infuscada grisácea-parda; venas posteriores sin macrotriquias; base de la M más larga que la bifurcación de M (Figura 2G).

Figura 2. Vista lateral de adulto de Bradysia impatiens Johannsen, 1912. A) Hábito (♂); B) Cabeza vista frontal; C) Vista lateral de flagelómeros antenales; D) Palpo; E) Espolón tibial; F) Genitalia, vista ventral; G) Ala. Abreviaturas: flag I, flag II, flag III, flag IV, flag; XIV: primer, segundo, tercer, cuarto, décimo cuarto flagelómero antenal; tb spur: espolón tibial; goncx: gonocoxito; gonst: gonostilo; h: vena humeral; Sc: vena subcostal; R: vena radial; r-m: vena transversal radio medial; Rs: sector radial; R₁: primera vena longitudinal; C: vena costal; R₄₊₅: tercera vena longitudinal; M₁: primera rama de la vena media; M₂: segunda rama de la vena media; M₄: cuarta rama de la vena media; M₁₊₂: fusión de la primera y segunda rama de la vena media; M-fork: bifurcación de la vena medial; CuA: vena cubital anterior; an lb: lóbulo anal.

La identificación genética confirmó la identificación morfológica: los dípteros que emergieron de las cámaras de cría pertenecen a B. impatiens, con 99.6 % de identidad con las disponibles en Genbank (Figura 3, Cuadro 2). El árbol filogenético muestra la formación de dos grupos: Grupo 1, conformado por adultos del mosquito fungoso de 16 viveros forestales de las regiones Norte, Occidente, Centro y Golfo; Grupo 2, formado por un vivero del centro (Teoran Productores) y tres de la región del sur (Chiapas: Los Pocitos y San Agustín; Oaxaca: Tamazulapan).

Figura 3. Árbol filogenético construido con secuencias correspondientes al Citocromo oxidasa I (COI) de Bradysia impatiens Johannsen, 1912con el método maximum likelihood basado en el modelo de Tamura de tres parámetros (T92). Los porcentajes se calcularon con 5 000 réplicas de bootstrap.

Cuadro 2. Viveros con especies de pino con presencia de Bradysia impatiens Johannsen, 1912, clave de colecta y número de acceso en GenBank.

El alineamiento de las secuencias arrojó una matriz de 540 pb por secuencia. Este marcador molecular, Citocromo Oxidada I (COI), es útil para la identificación a nivel de especie a partir de estados inmaduros de Bradysia sp. (Shin et al., 2015). Además, se debe de considerar el diseño de un par de oligonucleótidos específicos para esta especie de mosquito fungoso negro a partir del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I (COI) en combinación con los oligonucleótidos LCO1490 y HCO2198, el cual ayudaría a identificar más rápido. Caso similar fue utilizado para identificar a B. odoriphaga Yang y Zhang en Japón (Arimoto, 2022).

La localización del mosquito fungoso negro en México es la siguiente: Ciudad de México, Estado de México, Michoacán, Morelos, Puebla y Tlaxcala (Villanueva et al., 2013; García, 2017), por lo que Chiapas, Chihuahua, Durango, Hidalgo, Jalisco, Oaxaca, Querétaro, Veracruz y Zacatecas corresponden a nuevos reportes para el país (Figura 1). Esta especie tiene un amplio intervalo de distribución, ya que las localidades donde está presente se ubican desde los 699 hasta 2 603 msnm y distancias de 800 a 1 800 km entre cada vivero, esto hace imposible que B. impatiens pueda migrar naturalmente (Cuadro 1, Figura 1).

Steffan (1981), Frouz y Nováková (2001) y Marín-Cruz et al. (2015a) mencionaron que el insecto tiene poca capacidad de vuelo, su duración de vida como adultos es de 4 a 6 días y sus hábitos impiden que pueda moverse a grandes distancias. Mohring et al. (2012) consideran que la diseminación de B. impatiens es principalmente por el ser humano.

La especie se ha registrado en Europa (Alemania, Azerbaiyán, España, Finlandia, Países Bajos, Irlanda, Italia, Letonia, Reino Unido, República Checa, Suiza y Ucrania), Asia (China, Corea del Sur, Japón y Rusia), América (Brasil, Canadá, Estados Unidos y Venezuela), África (Sudáfrica) y Oceanía (Australia) en cultivos bajo cubierta y en viveros (Menzel et al., 2003; Mohring et al., 2012; Shin et al., 2012). Esta especie de díptero causa pérdidas económicas considerables en el centro de país en la producción de plantas de Pinus montezumae Lamb., P. greggii Engelm. ex Parl., P. devoniana Lindl.(Syn.: P. michoacana Martínez 1948) y P. pseudostrobus Lindl.(López-Pérez et al., 2009; Marín-Cruz et al., 2015b; García et al., 2017; Marín et al., 2017).

Además, se tienen informes que B. difformis (como B. impatiens) se hospeda y se alimenta del tallo y de la raíz de la Nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex. Klotzch) (Villanueva-Sánchez et al., 2013) y otras ornamentales como ciclamen (Cyclamen sp. L.), clavel (Dianthus sp. L.), gerbera (Gerbera sp. L.), lirio (Lilium sp. L.), rosa (Rosa sp. L.), violeta africana (Saintpaulia sp. H. Wendl.) y geranio (Pelargonium sp. L'Hér.) (García, 2008; García-Pérez et al., 2021). Sin embargo, se debe considerar la presencia de otras especies del género, principalmente en la parte sur de México por formar parte de la región neotropical, donde existen pocos estudios relacionados con este grupo de insectos.

Para la región neotropical conformada por América del Sur, Centroamérica y el Caribe, se consignan aproximadamente 62 especies de Bradysia (Amorim, 1992). Broadley et al. (2018) han registrado en la región holártica a B. impatiens, B. ocellaris Comstock, 1882, B. tilicola Loew, 1850, Cosmosciara sp.Frey, 1942, Lycoriella agraria Felt, 1898, L. ingenua Dufour, 1939, L. sativae Johannsen, 1912 y Pnyxia scabiei Hopkins, 1895 como plaga por alimentarse del tejido vivo de las plantas.

La obtención de adultos de plantas con síntomas de daño del mosquito fungoso indica que puede habitar y reproducirse en especies del género Pinus, sin importar el hábito de crecimiento, requerimientos de humedad, el sistema de producción (contenedores o bolsa de polietileno) y el tipo de sustrato (composta, tierra de monte, corteza precomposteada, aserrín, turba, vermiculita o agrolita).

Por último, este estudio proporciona evidencia de que B. impatiens tiene una gran plasticidad para adaptarse a diferentes alturas, condiciones ambientales y hospederos. En este estudio, se reporta el mosco fungoso como el causante de pérdida de plantas en 17 especies de pino en 12 estados de la república mexicana y, como nuevos hospederos, se establecen 13 especies del género Pinus (P. arizonica, P. ayacahuite, P. cembroides, P. cooperi, P. douglasiana, P. durangensis, P. engelmannii, P. hartwegii, P. leiophylla, P. oaxacana, P. oocarpa, P. patula y P. teocote).

Conclusiones

Los resultados de la caracterización morfológica y análisis molecular del mosquito fungoso negro confirmaron que los ciáridos obtenidos de plántulas de pino corresponden a Bradysia impatiens, que es el causante de la pérdida de ejemplares en 17 especies de pino de cinco regiones de México. De las 17 especies, 13 constituyen registros nuevos como hospederas de la especie de díptero (Pinus arizonica, P. ayacahuite, P. cembroides, P. cooperi, P. douglasiana, P. durangensis, P. engelmannii, P. hartwegii, P. leiophylla, P. oaxacana, P. oocarpa, P. patula y P. teocote). Además, se registra por primera vez el mosquito fungoso en nueve estados: Chiapas, Chihuahua, Durango, Hidalgo, Jalisco, Oaxaca, Querétaro, Veracruz y Zacatecas. Actualmente, B. impatiens se conoce en 15 estados del país.

Agradecimientos

Al Conacyt por el apoyo de la beca de estancia postdoctoral; a la Maestría en Ciencias Forestales por recibir al primer autor para realizar una estancia postdoctoral; a la Dra. Amparo Borja de la Rosa por toda la confianza y apoyo brindado; a los viveristas que amablemente permitieron el acceso y toma de muestra en sus instalaciones. Al Fondo Sectorial Conacyt-Conafor 2018-1 A-S-67865 mediante el proyecto “Monitoreo, evaluación de daños, manejo preventivo y control de la secadera y pudrición de raíz causadas por Fusarium spp., y las moscas fungosas Bradysia y Lycoriella”.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de interés.

Contribución por autor

Víctor Hugo Marín Cruz: colecta en campo e identificación, elaboración y corrección del manuscrito; David Cibrián Tovar y Silvia Edith García Díaz: elaboración y corrección del manuscrito; Omar Alejandro Pérez Vera: análisis filogenético, elaboración y corrección del manuscrito; Herón Huerta Jiménez: identificación y toma de fotografías; Edgar Magdaleno Hernández: elaboración del manuscrito.

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