remcfRevista mexicana de ciencias forestalesRev. mex. de cienc. forestales2007-1132Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias10.29298/rmcf.v13i69.1088Artículo científicoEstablecimiento de novo de un cultivo in vitro de una línea celular derivada del intestino de moscas sierra (Hymenoptera: Diprionidae)0000-0002-1345-797XTapia-UrizaTania Rocío10000-0003-3681-2492Cossío-BayúgarRaquel10000-0002-2296-8210González-GaonaErnesto20000-0002-2768-7012Lira-RamosKarla Vanessa De2Rodríguez-CruzYahaira Elizabeth20000-0002-0464-3666Miranda-MirandaEstefhan1*Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Salud Animal e Inocuidad. México. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y PecuariasInstituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y PecuariasCentro Nacional de Investigación Disciplinaria en Salud Animal e InocuidadMexicoInstituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Campo Experimental Pabellón, CIR-Norte Centro. México.Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y PecuariasInstituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y PecuariasCampo Experimental PabellónMexico
Autor para correspondencia; correo-e: miranda.estefhan@inifap.gob.mx
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Tania Rocío Tapia-Uriza, Raquel Cossío-Bayúgar y Estefhan Miranda-Miranda: diseño del estudio, ejecución experimental y elaboración de manuscrito; Ernesto González-Gaona, Karla Vanessa De Lira-Ramos y Yahaira Elizabeth Rodríguez-Cruz: muestreo, revisión, análisis y discusión del documento.
10012022Jan-Feb20221369951110203202121092021Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative CommonsResumen
En México, los bosques de pino son afectados por plagas insectiles, dentro de las cuales destacan las avispas de la familia Diprionidae, conocidas como moscas sierra ―insectos causantes de defoliaciones en grandes extensiones de pinos y juniperus a lo largo del territorio nacional―, por lo que existe la necesidad de implementar medidas de control. Una estrategia es el uso de baculovirus que ha mostrado efectividad en varios países, con problemas similares, en donde se ha demostrado que los gamma-baculovirus infectan a las larvas de estas avispas, aumentan su mortalidad y con ello regulan sus poblaciones. En México se carece de estudios sobre la identificación, aislamiento y cultivo in vitro de gamma-baculovirus específicos para moscas sierra. En el presente escrito se analiza el establecimiento de una línea celular del hospedero de los virus, las moscas sierra, en especial de células epiteliales del intestino de las larvas; ya que, según las fuentes bibliográficas, el virus no es capaz de replicarse en otro tipo de órganos. El desarrollo de una línea celular resulta ser un poco laborioso, en particular cuando no se tienen antecedentes; por ello, se desarrolló un protocolo de establecimiento celular, con el cual se obtuvieron tanto las células requeridas, como cultivos primarios de diferentes órganos del estadio larval de las moscas sierra.
Palabras claveControl biológicocultivo celularcultivo in vitroepitelio intestinallíneas celularesmoscas sierraConacytConaforCONAFOR291304Introducción
El uso de Baculovirus para el control de plagas agrícolas se ha extendido a nivel comercial, y en la actualidad se aplica exitosamente en el control biológico de plagas del maíz, soya y algodón (Beas-Catena et al., 2014). Estos casos justifican la investigación sobre el uso de Baculovirus para controlar diferentes artrópodos que actúan como plagas forestales, y que causan graves daños en los bosques de pinos, cedros y encinos en distintas regiones de México.
Tal es el caso de las avispas de la familia Diprionidae, mejor conocidas como moscas sierra, estos insectos provocan la defoliación de miles de hectáreas de bosques de clima templado dentro del territorio mexicano, lo que origina cuantiosas pérdidas en recursos madereros (Gonzáles et al., 2014). En los últimos siete años se han registrado brotes epidémicos en Chihuahua, Durango, Guerrero, Jalisco, Oaxaca y San Luis Potosí, entre otros (González y Sánchez, 2018).
Los principales hospederos de las moscas sierra son especies de la familia Pinaceae y Cupresaseae, sus larvas ocasionan defoliaciones de los árboles al alimentarse de las acículas; aunque los daños provocados no causan la muerte de su hospedero, pero lo deja susceptible a otro tipo de plagas y enfermedades que podrían inducir severas afectaciones, incluso la muerte del árbol (González y Sánchez, 2018). La familia Diprionidae presenta varios géneros, en los bosques de México se han citado: Neodiprion spp., Monoctenus spp. y Zadiprion spp., como los principales responsables de las defoliaciones (Gonzáles et al., 2014).
En la actualidad, se utilizan distintos métodos para controlar este tipo de plagas, uno de ellos es el químico que, aunque es eficiente, causa severos daños al ambiente y afecta a otros organismos, por lo que se ha buscado implementar el uso del control biológico (Garcia-Robles et al., 2001). Al respecto, hay estudios en los que se utilizan hongos o bacterias entomopatógenas, pero estos afectan tanto a las moscas sierra, como a otras especies por lo que su uso no es recomendable para el biocontrol de esos insectos (González y Sánchez, 2018); por el contrario, los Baculovirus son específicos y eficientes para el control de las moscas sierra en los bosques de Canadá (Moreau et al., 2005).
Este tipo de virus pertenecen a la familia Baculoviridae, que poseen un genoma de ADN circular de doble cadena, cuyo tamaño varía desde 80 hasta 180 kpb. Los Baculovirus presentan dos fenotipos de viriones: los virus ocluidos (ODV) y los viriones brotantes (BV) que corresponden a su forma infectiva (Wang y Hu, 2019). Los que infectan a las moscas sierra pertenecen al género Gammabaculovirus, el cual se caracterizan por formar cuerpos de oclusión (OB) en el núcleo de las células del epitelio intestinal de las larvas, estas oclusiones también llamados poliedros son agregados de una proteína viral denominada poliedrina en el caso de los virus de poliedrosis nuclear (NPV), y granulina en los virus de granulosis (GV); ambas matrices proteícas brindan resistencia y estabilidad a las condiciones ambientales.
El insecto ingiere los OB y después de la ingesta, la matriz que los rodea es digerida en el intestino de la larva, debido a las condiciones alcalinas liberando a los BV, que son los que inician la infección sistémica del insecto, la cual desencadena su muerte.
Los Baculovirus se clasifican en cuatro géneros: Alphabaculovirus (NPV) y Betabaculovirus (GV) que afectan a lepidópteros; Gammabaculovirus (NPV) a Himenópteros y Deltabaculovirus (NPV) a Dípteros (Rohrmann, 2019; King et al., 2012). En Canadá se logró desarrollar una suspensión concentrada de NPV llamada Abietiv®, cuyo ingrediente activo es el virus de poliedrosis nuclear de Neodiprion abietis que se aplica de manera aérea en las zonas forestales afectadas por estos organismos. En bosques de abeto balsámico [Abies balsamea (L.) Mill.], se demostró la efectividad de este producto en el control de moscas sierra (Lucarotti et al., 2012).
El protocolo para la obtención de la suspensión viral consiste en la concentración del virus a partir de larvas infectadas, producto que se genera de manera cíclica; ya que en la región forestal donde se esparce, y una vez que se constata que las larvas mueren por la infección viral, se colectan los cadáveres que se consideran material infectante para la elaboración de un nuevo lote de la suspensión viral, esto se realiza sucesivamente cada que se requiere utilizar el biopesticida; sin embargo, los costos de producción son grandes (Moreau et al., 2005).
Una solución para evitar el procedimiento antes descrito es el cultivo in vitro del Baculovirus. Para ello, se necesita implementar un cultivo celular capaz de replicar el virus y obtener cantidades considerables del mismo (Rohrmann, 2019).
Actualmente, se han establecido distintos cultivos de células hospederas de AlphaBaculovirus, pero dada su alta especificidad es muy difícil utilizarlos para cultivar Gammabaculovirus (Lucarotti et al., 2012), por lo que es necesario el desarrollo de líneas celulares de diferentes géneros de moscas sierra destinadas a la obtención y propagación de un Gammabaculovirus que afecte a especies mexicanas de avispas dipriónidas y que sea útil para su control biológico. Estos Baculovirus comienzan la fase infectiva y su replicación en el intestino de las larvas, y acorde a los antecedentes bibliográficos es el único órgano susceptible de infectarse, por esa razón el cultivo celular tiene que derivarse de células intestinales epiteliales (Lucarotti et al., 2012).
El objetivo del presente trabajo es implementar una técnica de obtención de un cultivo celular de diferentes especies de moscas sierra a partir de larvas de los géneros de Neodiprion spp. y Monoctenus spp.; para lo cual se siguieron técnicas de cultivos celulares aplicadas en otros artrópodos (Cossio-Bayugar y Miranda-Miranda, 2007; Mosqueda et al., 2008), en lepidópteros y para Alfabaculovirus (Summers y Smith, 1987).
Materiales y MétodosObtención y manejo de las muestras
Las larvas de avispas dipriónidas fueron proporcionadas por el Laboratorio de Sanidad Forestal y Agrícola del Campo Experimental Pabellón en Aguascalientes (INIFAP-CIR Norte Centro-Cepab), recolectadas en bosques de pino y de cedro blanco en Hidalgo y Guerrero, respectivamente durante actividades del proyecto Conafor 2017 C02 Núm. 291304. Se recibieron lotes de aproximadamente 50 larvas, las correspondieron a dos géneros: Neodiprion sp. y Monoctenus sp. Se guardaron en botes de plástico a 4 °C hasta su uso.
Lavado y disección de las muestras
Se seleccionaron cinco larvas de cada género, que se lavaron con distintas soluciones desinfectantes, consistentes en una solución de Benzal al 100 %. Posteriormente, se colocaron en un tubo cónico de 15 mL con 5 mL de Benzal y se dejaron en agitación durante 10 min; después, se desechó el Benzal y se agregaron 5 mL de Etanol al 70 %, nuevamente se colocaron en agitación durante 10 min; por último, se realizó un lavado con agitación durante 30 min en 5 mL de ABAM (antibiótico-antimicótico Gibco®; concentración final Penicilina 100 U mL-1, estreptomicina U mL-1 y Fungizona (anfotericina B) 0.25 (g mL-1) (Cossio-Bayugar y Miranda-Miranda, 2007). Se disectaron los órganos con una navaja bisturí estéril, se realizaron dos cortes: uno en el abdomen posterior y el otro en el anterior, este corte provocó la exposición del intestino, el cual se tomó con unas pinzas en medio y se colocaron en microtubos de 1500 (L con ABAM. Para la identificación del intestino de las larvas, se realizó una comparación con fotografías de Neodiprion abietis (Lucarotti et al., 2011). Una vez identificado el tracto intestinal y órganos accesorios, se continuó con el protocolo para la obtención de líneas celulares que se describe a continuación.
Glándulas salivales y red intersticial celular
Estos órganos accesorios del intestino, se colocaron por separado en un tubo de Eppendorf de 1.5 mL y se realizó un lavado con 500 µL de ABAM, durante 10 min en agitación; enseguida, se decantó el ABAM 1X y se les agregó 500 µL de solución balanceada de Hank's (HBSS, ThermoFisher Scientific) 1X.; posteriormente, se centrifugaron a 2 000 rpm durante dos min; por último, se retiró la solución HBSS 1X y se añadieron 500 µL de un medio de cultivo preparado con partes iguales de medio mínimo esencial (MEM; ThermoFisher Scientific), medio Leibovitz L-15 (ThermoFisher Scientific), suplementado con 20 % de suero fetal de bovino (FBS; Gibco™, ThermoFisher Scientific), 10 % caldo soya tripticaseina (TSB; Sigma), una solución antibiótico antimicótico (ABAM, Gibco™,ThermoFisher Scientific; concentración final Penicilina 100 U mL-1, estreptomicina 100 U mL-1 y anphotericina B 0.25 ug mL-1) (Cossio-Bayugar y Miranda-Miranda, 2007).
Los órganos fueron suspendidos en el medio y se añadieron a placas de cultivo de 12 pozos (Corning), cada uno contenía 2.5 mL de MEM suplementado fresco, el volumen final del cultivo fue de 3 mL en cada pozo de una placa de 12 pozos; la placa se mantuvo a una temperatura de 28 °C y una atmosfera de 5 % de CO2 (Mosqueda et al., 2008; Cossio-Bayugar et al., 2011).
Intestino
Los intestinos obtenidos de la disección se colocaron en un tubo Eppendorf de 1.5 mL con 500 µL de ABAM 1X durante 10 min; terminado el tiempo de incubación se centrifugó a 2 000 rpm por dos min, para sedimentar los intestinos; se decantó el ABAM 1X y se les agregó 500 µL de HBSS para realizar un lavado, se repitió la centrifugación e igualmente se decantó el HBSS 1X; una vez que estuvieron limpios los intestinos, se adicionaron 500 µL de medio de cultivo y se procedió a realizar la disgregación mecánica con una punta de micropipeta de 1 000 (L, mediante una presión ligera de los intestinos. Finalmente, las células disgregadas se suspendieron en 2.5 mL de MEM suplementado que estaba en cajas de cultivo celular de 12 pozos, el volumen total de cultivo fue de 3mL por pozo; los cultivos se mantuvieron a 28 °C en una atmosfera de 5 % de CO2 (Mosqueda et al., 2008; Cossio-Bayugar et al., 2011; Lucarotti et al., 2011).
Los cultivos se verificaron diariamente en un microscopio invertido Zeiss Axiovert 40.
ResultadosMorfología de los intestinos de las larvas de moscas sierra
Se identificaron diferentes órganos de las moscas sierra de la zona torácica-abdominal, entre los que destacan: el intestino, las glándulas salivales y la red intersticial de células (Figura 1a).
a. Aspecto del intestino de una larva de <italic>Monoctenus</italic> sp., Intestino o canal alimentario de larva (I), intestino anterior (IA), intestino medio (IM), intestino posterior (IP), glándulas salivales (GS), red intersticial celular (RI), barra escala 2mm. b. Intestino de larva <italic>Monoctenus</italic> sp.<italic>,</italic> intestino anterior (IA), intestino medio (IM) e intestino posterior (IP). Las flechas señalan la unión que delimita cada sección del intestino. En el intestino medio se diferencia el bolo alimenticio de la larva, barra escala 2 mm. c. Células epiteliales del intestino de larvas del género <italic>Neodiprion</italic> sp., son células de morfología cilíndrica con núcleo definido, barra escala 100 µm. d. Aglomerado de células epiteliales intestinales de larvas de <italic>Neodiprion</italic> sp.<italic>,</italic> núcleo celular definido (flecha), barra escala 50 µm. e. Células epiteliales del intestino de larvas del género <italic>Monoctenus</italic> sp., son células de morfología cubica con núcleo definido, barra escala 100 µm. f. Aglomerado de células epiteliales del intestino de larvas del género <italic>Monoctenus</italic> sp., núcleo celular definido (flecha), barra escala 25 µm. g. Glándulas Salivales (GS) de larvas del género <italic>Monoctenus</italic> sp. barra escala 2 mm. h. Cultivo celular de glándulas salivales de <italic>Monoctenus</italic> sp.<italic>,</italic> célula granulada (CG), ductos alargados (D). Las células rodean los ductos transparentes a lo largo de todas las glándulas celulares, barra escala 100 µm. i. Cultivo celular de red intersticial de <italic>Monoctenus</italic> sp.<italic>,</italic> red intersticial formada por la unión de las células (RI), célula vacuolada granulada (CV), barra escala 100 µm. Imágenes tomadas al microscopio óptico usando objetivo 40X.
Intestinos
El intestino se caracteriza por ser un tubo seccionado en tres partes: intestino anterior, medio y posterior (Figura 1b); una sección se diferencia por el angostamiento del inicio de cada porción. La parte anterior del intestino se conecta a la cavidad bucal, seguida por el intestino medio que es la porción más ancha del intestino y donde se encuentra la mayor cantidad de bolo alimenticio, por lo que se le atribuye la función de digerir el alimento, y finalmente, la región posterior que es el ducto más delgado, en comparación con las otras secciones (Figura 1b).
<bold>Cultivo celular de intestino del género <italic>Neodiprion</italic> sp<italic>.</italic>
</bold>
Las células epiteliales del intestino tienen características muy distintivas y comunes a la estructura celular del epitelio intestinal de los artrópodos; poseen un núcleo definido y tienen una morfología cúbica, plana o cilíndrica (Lucarotti et al., 2011). Los cultivos celulares obtenidos demostraron tener esas características (Figuras 1c y 1d); las células se revisaron cada tercer día y se observó que no había proliferación ni crecimiento celular. El tiempo aproximado de duración para este cultivo fue de un mes; debido a que no se registró una proliferación o crecimiento se consideró como un cultivo primario de intestino de la larva. El cultivo mostró una buena adaptación al medio MEM y a las condiciones de cultivo establecidas. La formación de aglomerados (Figura 1d) de las células y los residuos celulares del cultivo se deben al tipo de disgregación aplicada.
<bold>Cultivo celular de intestino del género <italic>Monoctenus</italic> sp<italic>.</italic>
</bold>
Los cultivos mostraron las mismas características morfológicas que las células epiteliales; sin embargo, en comparación con las células de Neodiprion sp. son más pequeñas y alargadas (Figura 1f). También, destacaron las aglomeraciones de pequeños grupos de células que no se disgregaron correctamente, el tiempo de cultivo celular se aproximó a un mes.
Glándulas salivales
Las glándulas salivales (Figura 1g) se observaron en una gran proporción, flanqueando el canal alimentario de la larva; son un par de ductos transparentes alargados que están rodeados por un gran número de células granuladas.
<bold>Cultivo celular de glándulas salivales de <italic>Neodiprion</italic> sp.</bold>
Es un órgano resistente a la manipulación y mostró tener una excelente tolerancia al medio de cultivo, se consideró como un cultivo primario ya que no presentó proliferación celular; la duración del cultivo fue mayor a los 3 meses y las células no presentaron adhesión a las placas de cultivo; y debido a su longevidad in vitro se consideran ideales para ensayos de infección (Figura 1h).
Red intersticial de células
Está formada por un conjunto de células granuladas unidas, rodea al intestino y a las glándulas salivales, su función podría ser fundamental en el cambio de muda de la larva (Figura 1a).
<bold>Cultivo celular de red intersticial de <italic>Neodiprion</italic> sp.</bold>
El cultivo celular se mantuvo alrededor de 1 mes con medio de cultivo, no hubo adhesión celular a la placa de cultivo y las células no evidenciaron ningún tipo de proliferación, ni crecimiento debido a que es un cultivo primario (Figura 1i).
Discusión
Las moscas sierra son himenópteros de la familia Diprionidae que ocasionan defoliaciones de hasta sesenta mil ha al año (González y Sánchez, 2018). Es por esta razón que se buscan métodos de control biológico eficientes y seguros que no provoquen daño al ambiente, o a especies endémicas no objeto de control. El uso de Baculovirus es eficiente para tratar este tipo de plagas; al respecto, hay numerosos ejemplos sobre la producción comercial de Alfa Baculovirus destinados al control de plagas agrícolas (Grzywcz et al., 2014; Grzywacz y Moore 2017), pero solo algunos ejemplos en la producción de suspensiones virales para el control de moscas sierra; un ejemplo es el uso del Gammabaculovirus NeabNPV que fue purificado y secuenciado por investigadores canadienses, cuyo uso aumentó la mortalidad de Neodiprion abietis y redujo los niveles de afectación a nivel endémico (Moreau et al., 2005).
Durante el presente estudio se establecieron varias líneas celulares de moscas sierra a partir de los intestinos y órganos accesorios intestinales que se consideran como una herramienta esencial para la obtención, caracterización y propagación de un Gammabaculovirus utili en el control biológico y en estudios de metabolismo celular de estas plagas forestales en México.
La producción de un cultivo celular puede tardar meses e incluso años; actualmente, no existe ningún registro de una línea celular de las moscas sierra de la familia Diprionidae en México. Los resultados obtenidos reflejan un gran avance para el establecimiento de una línea celular de epitelio intestinal. Este tipo de células es el único que puede incubar un virus para su replicación y propagación (Lucarotti et al., 2012), por lo que es importante tener un método para su cultivo y definir las condiciones adecuadas para la incubación de las células.
Existen diferencias celulares entre los distintos géneros de moscas (Neodiprion y Monoctenus), especialmente en la forma y el tamaño. Las células de Monoctenus son más pequeñas y de forma cúbica; mientras que, las células del género Neodiprion son cilíndricas y de mayor tamaño, ambos cultivos celulares presentaron una duración de aproximadamente un mes, las condiciones establecidas fueron adecuadas para su mantenimiento, y aunque no hubo proliferación o crecimiento celular son buenos candidatos para la infección con el Baculovirus, debido a que los virus pueden multiplicarse en los núcleos celulares de las células epiteliales intestinales; lo anterior se observó de manera notable, ya que un núcleo definido abarcaba gran parte de la célula.
Las aglomeraciones de células formadas en los cultivos podrían deberse a la deficiencia en la disgregación mecánica; por lo que no se descarta el uso de un método químico para la separación de las células, mediante el uso de enzimas como la colagenasa, tripsina, elastasa, papaína o pronasa (Beltrán y Gonzáles, 2016). Este tipo de enzimas ayudarían con la correcta disgregación de los tejidos y se utilizarían junto con la disgregación mecánica. Debido al tipo de disgregación empleada el cultivo mostró una gran cantidad de sedimentos celulares, por lo que se considera que podría implementarse el uso de un filtro que ayuda en la separación de las células con los sedimentos celulares, ya que con ello se obtendría un cultivo más limpio, sin sedimentos en el fondo de la placa de cultivo.
Los lavados después de la disección de los órganos es un paso importante para evitar alguna contaminación en el cultivo; aunque estos se realizaron de manera estricta y siempre en condiciones estériles, los cultivos de intestino presentaron contaminación por levaduras no identificadas, es importante resaltar que el antimicótico estaba al doble de concentración en el medio utilizado. La contaminación de los cultivos del intestino podría atribuirse a la flora intestinal de la larva; lo cual se evitaría con la separación por filtración de las células, con ello se impediría que los organismos responsables de la contaminación se cultiven junto con las células epiteliales intestinales. El medio utilizado se emplea para cultivo de artrópodos (Cossio-Bayugar y Miranda-Miranda, 2007).
A pesar de que no se presentan resultados sobre el funcionamiento de los cultivos obtenidos de glándulas salivales y de la red intersticial celular, no se descarta que pudiesen utilizarse en investigaciones posteriores para entender cuestiones biológicas de las larvas de la familia Diprionidae. Estos cultivos son más fáciles de manejar que los de intestino, ya que tienen menor probabilidad de contaminación. Sin embargo, en comparación con la fijación estos tejidos permanecen flotando en el medio; por ello, se propone reducir el volumen del medio de cultivo MEM, o bien disminuir el área de la placa de cultivo.
Conclusiones
El establecimiento de un cultivo celular de células epiteliales intestinales es posible siguiendo el protocolo descrito en este trabajo. Cada género de larva podría tener células con diferencias morfológicas, por lo que se propone el estudio de los tres géneros de mosca cierra registrados para la república mexicana (Monoctenus, Neodiprion y Zadiprion). Las condiciones de incubación de las células son adecuadas para el mantenimiento de los cultivos: 28 °C de temperatura y atmosfera de 5 % de CO2. El medio de cultivo MEM- Leibovitz L-15 (1:1) suplementado al 20 % con SFB y 10 % caldo soya tripiticaseina es adecuado para el mantenimiento y nutrición de las células; el cambio o agregación de las células se requiere para prolongar la vida de los cultivos celulares. Los cultivos primarios establecidos son candidatos para la identificación, caracterización, proliferación y mantenimientos de un Gammabaculovirus debido a las características morfológicas de las células.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por fondo Sectorial Conacyt-Conafor, proyecto CONAFOR 2017 CO2 núm. 291304.
ReferenciasBeas-Catena, A., A. Sánchez-Mirón, F. García-Camacho, A. Contreras-Gómez and E. Molina-Grima. 2014. Baculovirus biopesticides: An overview. Journal of Animal and Plant Sciences 24(2): 362-373. http://www.thejaps.org.pk/docs/v-24-2/02.pdf (6 de junio 2021).Beas-CatenaA.Sánchez-MirónA.García-CamachoF.Contreras-GómezA.Molina-GrimaE.2014Baculovirus biopesticides: An overviewJournal of Animal and Plant Sciences242362373http://www.thejaps.org.pk/docs/v-24-2/02.pdf6 de junio 2021Beltrán V., N. E. y C. H. Gonzáles de R. 2016. Técnicas de cultivos celulares e ingeniería de tejidos. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Cuajimalpa Ciudad de México, Mexico. pp. 74-89.Beltrán V.N. E.Gonzáles de RC. H.2016Técnicas de cultivos celulares e ingeniería de tejidosUniversidad Autónoma MetropolitanaMexico7489Cossio-Bayugar, R. and E. Miranda-Miranda. 2007. Heterologus gene expression in a cattle tick Rhipicephalus microplus embryonic cell culture. Journal of Animal and Veterinary Advances 6: 1214-1218. https://medwelljournals.com/abstract/?doi=javaa.2007.1214.1218 (6 de junio de 2021).Cossio-BayugarR.Miranda-MirandaE.2007Heterologus gene expression in a cattle tick Rhipicephalus microplus embryonic cell cultureJournal of Animal and Veterinary Advances612141218https://medwelljournals.com/abstract/?doi=javaa.2007.1214.12186 de junio de 2021Cossio-Bayugar, R. , C. Rojas Martinez, E. Miranda-Miranda, J. A. Alvarez-Martinez, J. V. Figueroa Millan, y C. A. Vega y Murguia. 2011. Cultivo in vitro Células Animales y sus Aplicaciones. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícola y Pecuarias, Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria, Jiutepec, Mor., México. Libro técnico 3. pp. 82-95.Cossio-BayugarR.Rojas MartinezC.Miranda-MirandaE.Alvarez-MartinezJ. A.Figueroa MillanJ. V.Vega y MurguiaC. A.2011Cultivo in vitro Células Animales y sus AplicacionesInstituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícola y PecuariasCentro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología VeterinariaJiutepec, Mor., México38295Garcia-Robles, I., J. Sánchez, A. Gruppe, A. C. Martínez-Ramírez, C. Rausell, M. D. Real and A. Bravo. 2001. Mode of action of Bacillus thuringiensis PS86Q3 strain in hymenopteran forest pests. Insect Biochemistry and Molecular Biology 31: 849-856. Doi: 10.1016/s0965-1748(01)00030-3.Garcia-RoblesI.SánchezJ.GruppeA.Martínez-RamírezA. C.RausellC.RealM. D.BravoA.2001Mode of action of Bacillus thuringiensis PS86Q3 strain in hymenopteran forest pestsInsect Biochemistry and Molecular Biology3184985610.1016/s0965-1748(01)00030-3González G., E. y G. Sánchez M. 2018. Identificación y manejo de moscas sierrade la familia Diprionidae presentesen el centro norte de México. Comisión Nacional Forestal. Folleto técnico, pp 1-98 Folleto técnico, pp 1-98 http://sivicoff.cnf.gob.mx/ContenidoPublico/09%20Manuales%20t%C3%A9cnicos/Manual%20moscas%20sierra.pdf (6 de junio de 2021).González G.E.Sánchez MG.2018Identificación y manejo de moscas sierrade la familia Diprionidae presentesen el centro norte de MéxicoComisión Nacional Forestal198 Folleto técnico, pp 1-98 http://sivicoff.cnf.gob.mx/ContenidoPublico/09%20Manuales%20t%C3%A9cnicos/Manual%20moscas%20sierra.pdf6 de junio de 2021González G., E. , F. Bonilla T., S. Q. Quiñones B., G. S. Sánchez M., F. Tafoya R., M. P. España L., J. Lozano G. y S. Robles U. 2014. Guía para la identificación de moscas sierra de la familia diprionidae presentes en el centro norte de México. Centro de Investigación Regional Norte Centro, Campo Experimental Pabellón, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarios., Aguascalientes, Ags., Mexico. Publicación especial Núm. 41. pp. 1-33.González G.E.Bonilla T.F.Quiñones B.S. Q.Sánchez M.G. S.Tafoya R.F.España L.M. P.Lozano G.J.Robles US.2014Guía para la identificación de moscas sierra de la familia diprionidae presentes en el centro norte de MéxicoInstituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y PecuariosAguascalientes, Ags., Mexico41133Grzywacz, D. and S. Moore. S. (2017). Production, Formulation, and Bioassay of Baculoviruses for Pest Control. In: Lacey, L. A. (ed.). Microbial Control of Insect and Mite Pests. Elsevier. San Diego, CA, USA. pp. 109-124.GrzywaczD.Moore. SS.2017Production, Formulation, and Bioassay of Baculoviruses for Pest ControlLaceyL. A.Microbial Control of Insect and Mite PestsElsevierSan Diego, CA, USA109124Grzywacz, D. , D. Moore and J. R. Rabindra. 2014. Mass production of entomopathogens in less industrialized countries. In: Morales-Ramos, J. A., G. M. Rojas and I. D. Shapiro-Ilan (eds.). Mass production of beneficial organisms. Londo, UK. Academic Press. pp. 519-553.GrzywaczD.MooreD.RabindraJ. R.2014Mass production of entomopathogens in less industrialized countriesMorales-RamosJ. A.RojasG. M.Shapiro-IlanI. D.Mass production of beneficial organismsLondo, UKAcademic Press519553King, A. M. Q., M. J. Adams, E. B. Carstens and E. J. Lefkowitz (eds.). 2012. Family - Baculoviridae. In: Virus Taxonomy. Elsevier. San Diego, CA, USA. pp. 163-173. Doi: 10.1016/B978-0-12-384684-6.00013-6. KingA. M. Q.AdamsM. J.CarstensE. B.LefkowitzE. J.2012Family - BaculoviridaeVirus TaxonomyElsevierSan Diego, CA, USA16317310.1016/B978-0-12-384684-6.00013-6Lucarotti, C. J., B. H. Whittome-Waygood and D. B. Levin. 2011. Histology of the Larval Neodiprion abietis (Hymenoptera: Diprionidae) Digestive Tract. Psyche: A Journal of Entomology e910286. Doi: 10.1155/2011/910286.LucarottiC. J.Whittome-WaygoodB. H.LevinD. B.2011Histology of the Larval Neodiprion abietis (Hymenoptera: Diprionidae) Digestive TractPsyche: A Journal of Entomologye91028610.1155/2011/910286Lucarotti, C. J. , B. H. Whittome-Waygood, R. Lapointe, B. Morin and D. B. Levin. 2012. Pathology of a Gammabaculovirus in its natural balsam fir sawfly (Neodiprion abietis) host. Psyche: A Journal of Entomology e646524. Doi: 10.1155/2012/646524.LucarottiC. J.Whittome-WaygoodB. H.LapointeR.MorinB.LevinD. B.2012Pathology of a Gammabaculovirus in its natural balsam fir sawfly (Neodiprion abietis) hostPsyche: A Journal of Entomologye64652410.1155/2012/646524Moreau, G., C. J., Lucarotti, E. G., Kettela, G. S., Thurston, S., Holmes, C., Weaver, D. B. Levin and B. Morin. 2005. Aerial application of nucleopolyhedrovirus induces decline in increasing and peaking populations of Neodiprion abietis. Biological Control 33: 65-73. Doi: 10.1016/j.biocontrol.2005.01.008.MoreauG.LucarottiC. J.KettelaE. G.ThurstonG. S.HolmesS.WeaverC.LevinD. B.MorinB.2005Aerial application of nucleopolyhedrovirus induces decline in increasing and peaking populations of Neodiprion abietisBiological Control33657310.1016/j.biocontrol.2005.01.008Mosqueda, J., R. Cossío-Bayugar, E. Rodríguez, A. Falcón, A.Ramos, J. V., Figueroa, and A. Alvarez. 2008. Primary midgut, salivary gland, and ovary cultures from Boophilus microplus. Annals of the New York Academy of Sciences 1149: 49-52. Doi: 10.1196/annals.1428.050.MosquedaJ.Cossío-BayugarR.RodríguezE.FalcónA.RamosA.FigueroaJ. V.AlvarezA.2008Primary midgut, salivary gland, and ovary cultures from Boophilus microplusAnnals of the New York Academy of Sciences1149495210.1196/annals.1428.050Rohrmann, G. F. 2019. Baculovirus Molecular Biology. 4th Edition. National Center for Biotechnology Information. Bethesda, MD, USA. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK543458/ (6 junio de 2021).RohrmannG. F2019Baculovirus Molecular Biology4thNational Center for Biotechnology InformationBethesda, MD, USAhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK543458/6 junio de 2021Summers, M. D. and G. E. Smith. 1987. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures. Texas Agricultural Experiment Station, College Station. Texas, USA. Bulletin 1555: 1-60. https://oaktrust.library.tamu.edu/handle/1969.1/145892 (6 de junio de 2021). SummersM. D.SmithG. E.1987A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture ProceduresCollege StationTexas, USA1555160https://oaktrust.library.tamu.edu/handle/1969.1/1458926 de junio de 2021Wang, M. and Z. Hu. 2019. Cross-talking between baculoviruses and host insects towards a successful infection. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 374: 20180324. Doi: 10.1098/rstb.2018.0324.WangM.HuZ.2019Cross-talking between baculoviruses and host insects towards a successful infectionPhilosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences374201803242018032410.1098/rstb.2018.0324Scientific articleDe novo establishment of an in vitro cell line culture derived from the intestine of sawflies (Hymenoptera: Diprionidae)
The authors declare no conflict of interests.
Tania Rocío Tapia-Uriza, Raquel Cossío-Bayúgar and Estefhan Miranda-Miranda: study design, experimental execution and manuscript elaboration; Ernesto González-Gaona, Karla Vanessa De Lira-Ramos and Yahaira Elizabeth Rodríguez-Cruz: sampling, review, analysis and discusión of the document.
Abstract
Pines, cedars and oaks forests are affected by different arthropod pests, one of which are the wasps of the family Diprionidae commonly known as sawflies. Swarms of these organisms cause defoliation on large extensions of pines and oaks along the national territory, and there is an urgent need to implement measures for the control of sawflies. One successful measure applied in other countries with similar forest pest control issues is the use of specific baculoviruses for the control of Diprionidae wasps, which has proved to be effective in the biological control of sawflies by infecting the larval stage of theses wasps, and thus increasing their mortality. However, there are no current projects in México that evaluate the identification and isolation of gamma-baculovirus destined to the biological control of forest pests. Our study addresses the technical difficulties of obtaining an intestinal cell line from Diprionidae sawflies, and we report the isolation and in vitro culture of intestinal cells.
The use of baculoviruses for the control of agricultural pests has spread commercially, and is currently being successfully applied in the biological control of corn, soybean, and cotton pests (Beas-Catena et al., 2014). These cases justify the research on the use of baculoviruses to control different arthropods that act as forest pests and cause serious damage to pine, cedar, and oak forests in different regions of Mexico.
Such is the case of wasps of the Diprionidae family, better known as sawflies, which cause the defoliation of thousands of hectares of temperate forests in Mexico, resulting in substantial losses in timber resources (González et al., 2014). In the last seven years, epidemic outbreaks have occurred in Chihuahua, Durango, Guerrero, Jalisco, Oaxaca, and San Luis Potosí, among other states (González and Sánchez, 2018).
The main hosts of sawflies are species of the Pinaceae and Cupresaseae families, their larvae cause defoliation of trees by feeding on needles, and, although the damage caused does not in itself produce the death of the host, it leaves the latter susceptible to other types of pests and diseases that may result in severe damage and even the death of the tree (González and Sánchez, 2018). The Diprionidae family has several genera, among which Neodiprion spp., Monoctenus spp., and Zadiprion spp have been reported as the main ones responsible for defoliations in the forests of Mexico (González et al., 2014).
At present, different methods are used to control this type of pests. One of them is chemical; although efficient, it causes severe damage to the environment and affects other organisms, wherefore the use of biological control has been sought (García-Robles et al., 2001). In this regard, there are studies in which entomopathogenic fungi or bacteria are used, but they affect sawflies as well as other species; for this reason, their use is not recommended for the biocontrol of these insects (González and Sánchez, 2018). Baculoviruses, on the contrary, are specific and efficient for the control of sawflies in Canadian forests (Moreau et al., 2005).
This type of virus belongs to the Baculoviridae family, which has a double-stranded circular DNA genome ranging in size from 80 to 180 kpb. Baculoviruses exhibit two virion phenotypes: occluded viruses (ODV) and budding virions (BV) corresponding to their infective form (Wang and Hu, 2019). Those that infect sawflies belong to the genus gamma-baculovirus, which are characterized by forming occlusion bodies (OB) in the nucleus of the cells of the intestinal epithelium of the larvae. These occlusions, also called polyhedral, are aggregates of a viral protein called polyhedrin in nuclear polyhedrosis viruses (NPV), and granulin in granulosis viruses (GV); both protein matrices provide resistance and stability to environmental conditions.
The insect ingests the OBs, and after ingestion, the matrix surrounding them is digested in the larva's intestine due to the alkaline conditions, releasing the BVs, which initiate the systemic infection of the insect that results in its death.
Baculoviruses are classified into four genera: alpha-baculoviruses (NPV) and beta-baculoviruses (GV) affecting Lepidoptera; gamma-baculoviruses (NPV) affecting Hymenoptera and Deltabaculoviruses (NPV) affecting Diptera (Rohrmann, 2019; King et al., 2012). In Canada, a concentrated suspension of NPV called Abietiv®, whose active ingredient is the Neodiprion abietis nuclear polyhedrosis virus, was developed for aerial application in forest areas affected by these organisms. In balsam fir [Abies balsamea (L.) Mill.] forests, this product proved effective in the control of sawflies (Lucarotti et al., 2012).
The protocol for obtaining the viral suspension consists of the concentration of the virus from infected larvae, a product that is generated in a cyclic manner. Once the larvae are found to have died from the viral infection in the forest region where it has spread, the corpses are collected, as they are considered to be infective material to be used in the preparation of a new batch of the viral suspension. This procedure is carried out successively each time the biopesticide needs to be applied; however, its production costs are high (Moreau et al., 2005).
A solution for avoiding the procedure described above is the in vitro culture of baculoviruses. For this purpose, it is necessary to implement a cell culture capable of replicating the virus and obtaining considerable quantities of it (Rohrmann, 2019).
Currently, different cultures of alpha-baculovirus host cells have been established, but, given their high specificity, it is very difficult to use them to grow gamma-baculovirus (Lucarotti et al., 2012). Therefore, it is necessary to develop cell lines from different genera of sawflies in order to obtain and propagate a Gammabaculovirus that will affect Mexican species of diprionid wasps and thus be useful for their biological control. These baculoviruses start the infective phase and their replication in the intestine of the larvae, which, according to the bibliographic sources, is the only organ susceptible to infection; for this reason, the cell culture has to be derived from epithelial intestinal cells (Lucarotti et al., 2012).
The objective of the present work is to implement a technique for obtaining a cell culture of different species of sawflies from larvae of the genera Neodiprion spp. and Monoctenus spp. Cell culture techniques applied in other arthropods were used for this purpose (Cossio-Bayugar and Miranda-Miranda, 2007; Mosqueda et al., 2008) in Lepidoptera and for alpha-baculovirus (Summers and Smith, 1987).
Materials and MethodsSample collection and handling
Diprionid wasp larvae were provided by the Forestry and Agricultural Health Laboratory of the Pabellón Experimental Field in Aguascalientes (INIFAP-CIR North Center-Cepab), collected in pine and white cedar forests in Hidalgo and Guerrero, respectively, during activities of the project Conafor 2017 C02 No. 291304. Batches of approximately 50 larvae were received, which corresponded to two genera: Neodiprion sp. and Monoctenus sp. They were stored in plastic jars at 4 °C until use.
Sample washing and dissection
Five larvae of each genus were selected and washed with different disinfectant solutions, namely, a 100 % Benzal solution. Subsequently, they were placed in a 15 mL conical tube with 5 mL of Benzal and left in agitation for 10 min. Afterwards, the Benzal was discarded, and 5 mL of 70 % ethanol were added and again stirred for 10 minutes. Finally, the samples were washed with agitation for 30 min in 5 mL of ABAM (Gibco® antibiotic-antimycotic; final concentration Penicillin 100 U mL-1, streptomycin U mL-1, and Fungizone (amphotericin B) 0.25 (g mL-1)(Cossio-Bayugar and Miranda-Miranda, 2007). The organs were dissected with a sterile scalpel blade. Two cuts were made: one in the posterior abdomen, and the other, in the anterior abdomen; this cut caused the exposure of the intestine, which was taken with forceps in the middle and placed in 1500 (L microtubes with ABAM. For the identification of the larval gut, a comparison was made with photographs of Neodiprion abietis (Lucarotti et al., 2011). Once the intestinal tract and accessory organs were identified, the protocol for obtaining cell lines was continued as described below.
Salivary glands and cellular interstitial network
These accessory organs of the intestine were placed separately in a 1.5 mL Eppendorf tube and washed with 500 µL of ABAM for 10 min under agitation; ABAM 1X was then decanted, and 500 µL of Hank's balanced solution were added (HBSS, ThermoFisher Scientific) 1X.; then, they were centrifuged at 2 000 rpm for two minutes; Finally, the HBSS 1X solution was removed, and 500 µL of a culture medium prepared with equal parts of minimal essential medium were added (MEM; ThermoFisher Scientific). Leibovitz’s L-15 medium (ThermoFisher Scientific), supplemented with 20 % of fetal bovine serum (FBS; Gibco™, ThermoFisher Scientific), 10 % triptycasein soy broth (TSB; Sigma), an antifungal antibiotic solution (ABAM, Gibco™,ThermoFisher Scientific, a final concentration of 100 U mL-1 penicillin, 100 U mL-1 streptomycin, and B 0.25 ug mL-1 amphotericin) (Cossio-Bayugar and Miranda-Miranda, 2007).
The organs were suspended in the medium and added to 12-well culture plates (Corning), each containing 2.5 mL of fresh supplemented MEM. The final culture volume was 3 mL in each well of a 12-well plate; the plate was maintained at a temperature of 28 °C and in an atmosphere of 5 % CO2 (Mosqueda et al., 2008; Cossio-Bayugar et al., 2011).
Intestine
The intestines obtained from the dissection were placed in a 1.5 mL Eppendorf tube with 500 µL of ABAM 1X for 10 min; at the end of the incubation time, the intestines were centrifuged at 2 000 rpm for two min to sediment the intestines; the ABAM 1X was decanted, and 500 µL of HBSS were added for washing, the centrifugation was repeated, and the HBSS 1X was also decanted. Once the intestines were clean, 500 µL of culture medium were added and mechanical disintegration was performed with a 1 000 L micropipette tip, using light pressure on the intestines. Finally, the disaggregated cells were suspended in 2.5 mL of supplemented MEM, which was in 12-well cell culture boxes. The total culture volume was 3mL per well, and the cultures were maintained at 28 °C in an atmosphere of 5 % of CO2 (Mosqueda et al., 2008; Cossio-Bayugar et al., 2011; Lucarotti et al., 2011).
The cultures were checked daily under a Zeiss Axiovert 40 inverted microscope.
ResultsSawfly larval gut morphology
Different organs of sawflies from the thoracic-abdominal area were identified, including the intestine, the salivary glands, and the interstitial network of cells (Figure 1a).
a. Appearance of the intestine of a <italic>Monoctenus</italic> sp. larva, larval intestine or alimentary canal (I), foregut (FG), midgut (MG), hindgut (HG), salivary glands (SG), cellular interstitial network (IN), bar scale 2mm. b. Intestine of <italic>Monoctenus</italic> sp. larvae, foregut (FG), midgut (MG) and hindgut (HG). The arrows indicate the junction that delimits each section of the intestine. In the midgut, the larval cud is differentiated, bar scale 2 mm. c. Epithelial cells of the intestine of larvae of the genus <italic>Neodiprion</italic> sp. are cells of cylindrical morphology with a well-defined nucleus, scale bar 100 µm. d. Cluster of intestinal epithelial cells of <italic>Neodiprion</italic> sp. larvae, distinct cell nucleus (arrow), scale bar 50 µm. e. Epithelial cells of the intestine of larvae of the genus <italic>Monoctenus</italic> sp. are cells of cubic morphology with a well-defined nucleus, scale bar 100 µm. f. Cluster of epithelial cells from the intestine of larvae of the genus <italic>Monoctenus</italic> sp., well-defined cell nucleus (arrow), scale bar 25 µm. g. Salivary glands (SG) of larvae of the genus <italic>Monoctenus</italic> sp. bar scale 2 mm. h. Cell culture of salivary glands of <italic>Monoctenus</italic> sp., granulated cell (GC), elongated ducts (D). Cells surround the transparent ducts along all cell glands, bar scale 100 µm. i. <italic>Monoctenus</italic> sp. interstitial network cell culture, interstitial network formed by the junction of cells (IN), granulated vacuolated cell (VC), bar scale 100 µm. Images taken under the optical microscope using a 40X objective.
Intestines
The intestine is a tube sectioned into three parts: foregut, midgut and hindgut (Figure 1b). The sections are differentiated by the narrowness of the beginning of each portion. The anterior part of the intestine connects to the oral cavity, followed by the midgut which is the widest portion of the intestine and where the largest amount of food bolus is found, and therefore, is attributed the function of digesting food, and finally, the posterior region, which is the thinnest duct compared to the other sections (Figure 1b).
<bold>Intestinal cell culture of the genus <italic>Neodiprion</italic> sp<italic>.</italic>
</bold>
Intestinal epithelial cells have very distinctive characteristics common to the cellular structure of the intestinal epithelium of arthropods; they possess a defined nucleus and have a cubic, flat, or cylindrical morphology (Lucarotti et al., 2011). The cell cultures obtained were shown to have these characteristics (Figures 1c and 1d); the cells were checked every third day, and no cell proliferation and growth were observed. The approximate duration for this culture was one month; since no proliferation or growth was recorded, it was considered a primary culture of larval intestine. The culture showed good adaptation to the MEM medium and to the established culture conditions. The formation of clusters (Figure 1d ) of cells and cell debris in the culture is due to the type of disaggregation applied.
<bold>Intestinal cell culture of the genus <italic>Monoctenus</italic> sp<italic>.</italic>
</bold>
The cultures showed the same morphological characteristics as the epithelial cells; however, in comparison to the cells from Neodiprion sp., they are smaller and more elongated (Figure 1f). Also, they highlighted clusters of small groups of cells that did not disintegrate properly, cell culture time approached one month.
Salivary glands
Salivary glands (Figure 1g) were observed in a large proportion, flanking the larval alimentary canal; they are a pair of elongated transparent ducts that are surrounded by a large number of granulated cells.
<bold>Salivary gland cell culture from the salivary glands of <italic>Neodiprion</italic> sp.</bold>
It is an organ resistant to manipulation which exhibited excellent tolerance to the culture medium. It was considered as a primary culture since it did not show cell proliferation; the duration of the culture was above 3 months, and the cells did not adhere to the culture plates. Due to its longevity in vitro, it is considered ideal for infection assays (Figure 1h).
Interstitial cell network
It is formed by a group of granulated cells joined together. It surrounds the intestine and the salivary glands, and its function could be fundamental in the change of molt of the larva (Figure 1a).
<bold>Cell culture of interstitial network of <italic>Neodiprion</italic> sp.</bold>
The cell culture was maintained for about 1 month with culture medium. There was no cell adhesion to the culture plate, and the cells did not exhibit any type of proliferation or growth because it is a primary culture (Figure 1i).
Discussion
Sawflies are hymenopterans of the Diprionidae family that cause defoliation of up to 60,000 ha per year (González and Sánchez, 2018). This fact has led to the search for efficient and safe biological control methods that will not cause damage to the environment or to endemic species that are not subject to control. The use of baculovirus has proved efficient to treat this type of pests. There are numerous examples of commercial production of alpha baculoviruses for agricultural pest control (Grzywcz et al., 2014; Grzywcz and Moore, 2017.), but only a few examples of the production of viral suspensions for the control of sawflies. An example is the use of Gammabaculovirus NeabNPV, which was purified and sequenced by Canadian researchers, increasing the mortality of Neodiprion abietis and reducing the endemic levels of involvement (Moreau et al., 2005).
During the present study, several sawfly cell lines were established from the intestines and intestinal accessory organs, being regarded as an essential tool for the procurement, characterization and propagation of a gamma-baculovirus utili in the biological control and cellular metabolism studies of these forest pests in Mexico.
The production of a cell culture can take months or even years; today, there is no record of a cell line of sawflies of the family Diprionidae in Mexico. The results obtained reflect a breakthrough in the establishment of an intestinal epithelial cell line. This cell type is the only one that can incubate a virus for replication and propagation (Lucarotti et al., 2012). It is therefore important to have a method for their cultivation and to define the appropriate conditions for the incubation of the cells.
There are cellular differences between the different genera of flies (Neodiprion and Monoctenus), especially in shape and size. Monoctenus cells are smaller and cubic in shape; while Neodiprion cells are cylindrical and larger. Both cell cultures lasted approximately one month. The conditions established were adequate for their maintenance, and although there was no cell proliferation or growth, they are good candidates for infection with baculovirus, since the viruses can multiply in the cell nuclei of intestinal epithelial cells. The above was observed in a remarkable way, as a defined nucleus encompassed a large part of the cell.
The clusters of cells formed in the cultures could be due to a deficiency in mechanical disaggregation; hence, the use of a chemical method for the separation of cells using enzymes such as collagenase, trypsin, elastase, papain or pronase is not ruled out (Beltrán and Gonzales, 2016). This type of enzymes may help with proper tissue disaggregation and may be used in conjunction with mechanical disaggregation. Due to the type of disaggregation used, the culture showed a large amount of cellular sediments; therefore, the implementation of the use of a filter that will help in the separation of the cells with the cellular sediments is suggested, as it would result in a cleaner culture, without sediments at the bottom of the culture plate.
Washing after organ dissection is an important step to prevent any contamination in the culture; although the cultures were carried out strictly and always under sterile conditions, the intestine cultures were contaminated by unidentified yeasts. Notably, the antifungal was at twice the concentration in the medium used. Contamination of gut cultures may be attributed to larval gut flora. This may be prevented by separating the the cells through filtration; thus, the organisms responsible for the contamination would not be cultured together with the intestinal epithelial cells. The medium used is for arthropod culture (Cossio-Bayugar and Miranda-Miranda, 2007).
The absence, in the present study, of results on the functioning of cultures obtained from salivary glands and the cellular interstitial network does not preclude their use in further research to understand biological issues of the larvae of the Diprionidae family. These cultures are easier to handle than gut cultures, as they are less likely to be contaminated. However, these tissues are not fixed but remain floating in the medium; therefore, we propose reducing the volume of MEM culture medium or the size of the culture plate.
Conclusions
The establishment of a cell culture of intestinal epithelial cells is possible following the protocol described in this work. Each genus of larvae can have cells with morphological differences; therefore, we propose the study of the three genera of flies existing in the Mexican Republic (Monoctenus, Neodiprion, and Zadiprion). The incubation conditions of the cells are suitable for the maintenance of the cultures: 28 °C temperature and atmosphere of 5 % of CO2. MEM-Leibovitz L-15 (1:1) culture medium supplemented with 20 % SFB and 10 % trypticasein soy broth is suitable for cell maintenance and nutrition; cell exchange or aggregation is required to prolong the life of cell cultures. Established primary cultures are candidates for the identification, characterization, proliferation and maintenance of a gamma-baculovirus due to the morphological characteristics of the cells.
Acknowledgements
This research was fundend by the Conacyt-Conafor Sector Fund, CONAFOR 2017 CO2 project no. 291304.